ПЦР Real-time

ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) — В настоящее время на смену визуальной оценке результатов ПЦР методом электрофореза уверенно приходят флуоресцентные методы детекции продуктов амплификации. Получать и интерпретировать результаты ПЦР становится проще, быстрее и надежнее.

Одним из флуоресцентных методов является метод ПЦР в режиме реального времени. В его основе лежит принцип флуоресцентной детекции продуктов ПЦР непосредственно в ходе амплификации. Детекция продуктов амплификации проводится прямо в реакционной среде через стенки или крышку закрытой пробирки.

1. В состав реакционной смеси наряду с праймерами и остальными компонентами реакции добавлены специальные флуоресцентные метки (зонды). Флуоресцентный зонд представляет собой олигонуклеотид, комплементарный внутренней последовательности амплифицируемого фрагмента ДНК возбудителя. На 3’-конце зонда находится флуоресцентная молекула – флуорофор, а на 5’-конце расположена молекула-“гаситель” флуоресценции. За счет близости флуорофора и “гасителя” вся энергия, поглощенная флуорофором, переходит на “гаситель” по принципу флуоресцентно-резонансного переноса энергии. При этом сигнал флуоресценции отсутствует.

2. В ходе ПЦР при повышении температуры происходит денатурация ДНК возбудителя, и зонд наряду с праймерами гибридизуется с комплементарным участком ДНК.

3. В процессе синтеза новой цепи ДНК, фермент ДНК-полимераза расщепляет этот зонд. При расщеплении зонда флуорофор отделяется от “гасителя”, расстояние между ними увеличивается, процесс тушения флуоресценции становится невозможным. В этот момент можно зарегистрировать флуоресцентный сигнал от флуорофора.

В результате такого принципа неспецифическая амплификация не обнаруживается.

ПЦР “в реальном времени” имеет ряд значительных преимуществ:

• Объединение этапов амплификации и детекции результатов. Появляется возможность оценить кинетику процесса, которая зависит от начального количества исследуемого материала
• Существенное снижение риска контаминации и ошибок при анализе результатов
• Высокая специфичность реакции за счет использования высокоспецифичных флуоресцентных зондов.
• Высокая производительность
• Упрощение требований к организации ПЦР-лаборатории
• Возможность количественной оценки исходной ДНК матрицы
• Регистрация и учет данных в электронном формате

ПЦР “в реальном времени” характеризуется возможностью проведения качественного и количественного анализа. Регистрируемое в процессе амплификации нарастание сигнала от отделенного флуорофора прямо пропорционально увеличению концентрации синтезированных специфических продуктов и отражает концентрацию ДНК в исходной матрице.

Программное обеспечение наших приборов позволяет сопоставлять кинетику реакции в исследуемых и стандартных образцах и вычислять концентрацию исходной матрицы ДНК (в присутствии стандартных образцов с известной концентрацией анализируемой ДНК). При выявлении ДНК возбудителей инфекционных заболеваний целесообразно использовать данный метод в количественной оценке только тех инфекционных агентов, количественное содержание которых в анализируемом образце действительно имеет клиническую значимость. Определение количественных характеристик инфекции позволяет судить о динамике и стадии заболевания, а также об эффективности проводимой терапии.